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高敏PCR试剂盒(熔解确认版) ——快灵高敏试剂盒“PLUS”!

发布时间 : 2021-06-28 16:07:19

自2020年10月上海快灵发布“非洲猪瘟高敏PCR试剂盒”(下称高敏试剂盒)以来,其出色的灵敏度、敏感性、特异性及稳定性迅速被广大猪场实验室认可。随着荧光PCR相关技术的普及以及用户群体的增大,部分之前未被重视的问题也逐渐显露出来。本篇顺达平台登陆探讨下各厂家都讳莫如深的一个点——“假阳”问题,以及相应的解决方案。

“假阳”问题,事实上在荧光PCR领域并不少见,而造成假阳产生的原因也是纷繁复杂:如操作不当污染、环境气溶胶污染或者试剂生产过程污染等。本文所要探讨的“假阳”,主要指因试剂特异性导致的假阳,换句话说,即文中所提的“假阳”,与操作者、仪器、环境均无关,只与试剂盒内的试剂有关。那么试剂盒中到底什么与“假阳”相关呢?纵观商业化的非瘟病毒PCR检测试剂盒,其中都会提及一个重要参数——特异性。

何为特异性呢?在PCR扩增过程中,如果顺达平台登陆要扩增的非洲猪瘟DNA片段在整条DNA链上不止出现了一次,或者样品中混有的其他物种、细胞或病毒的DNA中含有类似的DNA片段,则可能会将其他片段扩增出来,那最后仪器显示出来的阳性结果就不一定是非瘟病毒DNA造成的,于是阳性结果也就变成了假阳。因此,通俗来说,特异性反应的是试剂盒能扩增出特定DNA片段的性能,特异性越低,则试剂盒扩增其他片段的概率就越大,即“假阳”几率更大。
  
市售的众多非瘟病毒PCR检测试剂盒中,绝大多数厂商在宣传其试剂盒特异性时均会标注>99%,最低也不会低于98%,快灵的高敏试剂盒也是如此,特异性可达到99.9%,属实是已经做到了极限,即使PCR技术发展至今,因为模板DNA的不确定,依然无法保证100%的特异性。也正因此,特异性,也就是假阳的问题是被大家忽视了。

在服务客户的过程中,顺达平台登陆发现很多客户在进行非瘟病毒检测遇到极弱样本或疑似样本时,对于阳性场,往往遵循的是宁杀错,不放过,而对于阴性场,往往带来心理的恐慌,需要确认到底是不是阳性。的确,随着非瘟一波波的袭来,各检测单位的工作量都史无前例的倍增,再重新来一遍的全面复核,显然是对人力和成本的巨大考验。面对这样的大环境,快灵人陷入了沉思。

“顺达平台登陆为什么要宁杀错?”

“当真没有办法消除假阳么?”

带着这样的问题,顺达平台登陆开始了新的一轮又一轮的尝试:提升试剂盒的灵敏度、将特异性由99%提升至99.9%……或许,顺达平台登陆可以把眼界放宽,不局限于单纯的扩增?

于是,高敏试剂盒上市半年后,顺达平台登陆在高敏试剂盒基础之上研发出其“升级版”——快灵高敏试剂盒(熔解确认版)。

快灵高敏试剂盒(熔解确认版),其性能参数与高敏试剂盒一致,顺达平台登陆同样保证其灵敏度、敏感性、稳定性、特异性处在行业顶尖水平,确保客户可以第一时间检测出阳性样本。包括其操作、扩增阶段也与高敏试剂盒别无二致,至此,顺达平台登陆可以把快灵高敏试剂盒(熔解确认版)等同于高敏试剂盒。详见表1:

表1:高敏试剂盒与假阳确认试剂盒基本性能参数对比

性能

高敏试剂盒

高敏试剂盒(假阳确认版)

灵敏度

400copies/mL

400copies/mL

敏感性

≥99.9%

≥99.9%

特异性

≥99.9%

≥99.9%

稳定性

CV<3%

CV<3%

规格

50T/

50T/

反应体系

25μL

25μL

反应时长

55min

55min(单扩增)

70min(扩增+熔解)

UDG

内标

 

但,重点来了!快灵是怎么做到的?快灵高敏试剂盒(熔解确认版)突破性地使用了一个新的反应程序——熔解曲线。熔解曲线能鉴别不同的DNA片段,依靠的不是Ct.值,而是其特有的熔解峰,即Tm值,即使一个DNA片段中仅相差一个碱基,都能导致Tm值变动。依靠Tm值的判定就可以确认之前扩增阳性的非瘟样本是否为真的非瘟阳性,以此达到鉴别假阳,消除客户疑虑的目的。

 

      

图1:扩增曲线Ct.值判读阴阳        图2:熔解曲线检测疑似/弱阳样本,排除假阳

非瘟新形势下,除了要求试剂盒更早的检测出阳性,更需要真正“精准”检测。快灵高敏试剂盒(熔解确认版)除了超高的灵敏度、特异性,更是“自带”熔解曲线,让假阳无处可藏,让弱阳“站得住脚”,真正做到打消客户疑虑,真正做到“不杀错、不放过”。


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